國立台灣大學醫學工程學所/王子威、吳錫芩、林峰輝、孫瑞昇

本研究的目的是希望以組織工程的方式發展出一個類皮膚的等價物（skin equivalent），來促進皮膚的修復與再生，藉以幫助臨床上大面積燒燙傷以及傷口難以癒合的病人。研究中將會評估製備出的明膠/軟骨硫素/透明質酸薄膜其孔洞型態，物理化學性質，以及生物相容性，是否適合當作皮膚再生的模型。接著是利用此模型評估其在體外建構出皮膚等價物的可行性。並進行活體動物移植實驗，瞭解其促進傷口修復與皮膚再生的能力。
首先需發展出一適合的皮膚支架(scaffold)，為了模擬皮膚細胞外基質的成分，本研究選用明膠/軟骨硫/透明質酸 (gelatin-chondroitin 6 sulfate- hyaluronic acid; G-C6S-HA)來當作基材。再利用不同冷凍速率之溫度下冷凍乾燥的方式形成具有雙層孔洞結構(bi-layer)的G-C6S-HA薄膜;並進一步利用碳二醯胺(carbodiimide)來交聯，以增進此G-C6S-HA薄膜的機械強度。細胞培養方面，培養過程中，首先利用本實驗室開發出的攪拌瓶反應器(spinner flask)，來種植皮膚真皮纖維母細胞(dermal fibroblast; FB)，以達到高種植效率，以及細胞均勻分佈的優點;接著再將此種植有真皮纖維母細胞的真皮等價物(dermal equivalent)，接種上表皮的角化細胞(epidermal keratinocyte; K)，之後將此皮膚等價物置於培養基液面下培養一段時間，再移到氣-液介面(air-liquid interface)讓皮膚表皮組織成熟分化。經過三到四週的培養，表皮角化細胞已能從基底層(basal layer)開始往上分化出基底上層(suprabasal layer)和角質層(cornified squamous layer);真皮纖維母細胞同時也開始分泌出自己的細胞外基質來逐漸取代原來的支架位置，並發展出一類似真皮的結構。

經由不同冷凍速率之溫度下冷凍乾燥的方式，可以成功製備出具有雙層孔洞結構的皮膚支架，上層(-196C)的孔隙度較小且較緻密，大約20~40m，適合表皮的角化細胞貼附與增生;下層(-80C)的孔隙度較大且較疏鬆，大約75~150m，適合真皮纖維母細胞在其中遷移和生長。而兩層中間的孔洞則是互相連通的，有利於細胞所分泌的細胞激素與生長因子的釋放，並進行對細胞的相互調控，以加速皮膚組織的快速生長與成熟分化。利用動態的攪拌瓶反應器來種植真皮纖維母細胞，發現比傳統的靜態方式或是藉由吸引力等方式，更能達到讓細胞均勻的分佈在支架的內部，不會聚集在某些特定區域，造成細胞在重建新的皮膚組織時，組織容易有不連續性與過度生長分化的情形產生。此外，細胞的存活率也比其他方式（例如：真空吸引，離心沈降）要來得高。

我們亦將此皮膚替代物移植到老鼠的背部，觀察其傷口癒合與皮膚再生的情形。結果發現，不管有無種植上細胞，四週後，老鼠的傷口皆能癒合，顯示出單純的材料本身就有減少傷口面積，促進組織再生的功能，如果有種植上細胞，則可以更有效的加速傷口癒合的時間，大約只需三週。而且新長出來的皮膚組織其機械強度良好，亦無疤痕或是組織沾黏的情形產生。根據上述之實驗結果可作出下列幾點結論：本研究利用不同冷凍速率下，加上冷凍乾燥的方式，可以製備出具有雙層孔洞結構的皮膚支架。此支架具有良好的物理化學性質及生物相容性。經過體外的培養，此支架會逐漸降解，被細胞所新分泌出來的細胞外基質所取代;數週後，能初步長出新的類似完整皮膚組織的結構，包括表皮層和真皮層。經由動物實驗發現，不僅能促進傷口修護與再生，新長出來的皮膚組織構造完整且具有適當的機械強度。未來在臨床上極具有應用潛力，可望嘉惠大面積燒燙傷需要進行皮膚移植卻沒有足夠體表面積的燒傷病患身上，或是傷口難以癒合的慢性病人身上。